El paciente debe sentarse derecho o acostarse de lado con la espalda paralela a la cama, la barbilla agachada y las piernas encorvadas adoptando una posición fetal. El médico utiliza las protrusiones óseas de la cadera para determinar la ubicación más adecuada para retirar el líquido. Esta es usualmente la ubicación que se conoce como nivel vertebral L3-L4. A continuación, se lava el área con yodo y se envuelve una gasa estéril sobre el área circundante. A los bebés y a los niños pequeños se les aplica crema EMLA, la cual es un anestésico local, una hora antes del procedimiento para insensibilizar la piel. A los adultos se les inyecta lidocaína inicialmente debajo de la piel y después a un nivel más profundo para que el tejido que se encuentra debajo de la piel también quede insensibilizado. Luego se inserta una pequeña aguja calibre 20 dentro del interespacio que hay entre las vértebras y dependiendo de la cantidad de tejido subcutáneo que haya, la penetración de la aguja será superficial o más profunda. Puede haber un "pop" audible cuando la aguja penetre en la duramadre (membrana que circunda la médula espinal y que contiene el líquido). En esta etapa del procedimiento ya el líquido estará saliendo de la aguja y éste se recogerá en recipientes plásticos. Bajo circunstancias normales, la presión inicial se mide con un manómetro y luego se recogen más o menos de 20 a 30 cc de líquido espinal para enviarlos a evaluación bajo el microscopio. Si este procedimiento lo realiza un médico experimentado no debe sentirse ningún tipo de dolor. Es posible que se tenga una sensación de presión al insertar la aguja, pero si se administra la anestesia adecuada no debe doler. En algunas ocasiones las personas sienten un entumecimiento que corre por las piernas, probablemente a causa de la irritación de la raíz de un nervio. Finalmente se retira la aguja, la sensación se calma y no es permanente. Después del procedimiento, se recomienda al paciente permanecer acostado durante una o dos horas para prevenir los dolores de cabeza por baja presión. El procedimiento completo tarda aproximadamente 20 minutos.
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